Диссертация (Морфологическое и функциональное обоснование регенераторной активности клеточных продуктов разных типов на модели травматического повреждения роговицы)

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждениевысшего образования «Московская государственная академия ветеринарноймедицины и биотехнологии – МВА имени К.И. Скрябина»На правах рукописиВологжанина Наталья ВладимировнаМорфологическое и функциональное обоснование регенераторнойактивности клеточных продуктов разных типов на моделитравматического повреждения роговицы06.02.01 – Диагностика болезней и терапия животных,патология, онкология и морфология животныхДиссертация на соискание учёной степеникандидата биологических наукНаучный руководитель:заслуженный деятель науки РФ,доктор биологических наук,профессор Слесаренко Н.А.Москва – 2017ОглавлениеВЕДЕНИЕ .................................................................................................................

1ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ......................................................................................... 8МЕЗЕНХИМНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ................................................................... 14CТРОМАЛЬНО-ВАСКУЛЯРНАЯ ФРАКЦИЯ ............................................................... 22СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ЛИМБА .................................................................................. 25СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ..............................................................

28МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ................................................................ 28РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХОБСУЖДЕНИЕ ..................................................................................................... 33МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ РОГОВИЦЫГЛАЗНОГО ЯБЛОКА КРОЛИКА В КОНТРОЛЕ ............................................................ 332.

КЛИНИЧЕСКИЕ И МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЗАЖИВЛЕНИЯРОГОВИЦЫ ГЛАЗА У ЖИВОТНЫХ КОНТРОЛЬНОЙ ГРУППЫ (САМОПРОИЗВОЛЬНОЕЗАЖИВЛЕНИЕ) .......................................................................................................... 372.1. КЛИНИЧЕСКАЯ КАРТИНА ................................................................................. 372.2. РЕЗУЛЬТАТЫ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯ ..................................... 403.

ЗАЖИВЛЕНИЕ РОГОВИЦЫ ГЛАЗА КРОЛИКА ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИАЛЛОГЕННЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЛИМБА .......................................................... 45(ЛИМБАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК – ЛСК) ....................................................... 453.1. КЛИНИЧЕСКАЯ КАРТИНА ................................................................................. 453.2. РЕЗУЛЬТАТЫ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ..................................... 474.

ЗАЖИВЛЕНИЕ РОГОВИЦЫ ГЛАЗА КРОЛИКА ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИАЛЛОГЕННЫХ МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЖИРОВОЙ ТКАНИ (ММСК)................................................................................................................................... 544.1. КЛИНИЧЕСКАЯ КАРТИНА ................................................................................. 544.2. РЕЗУЛЬТАТЫ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ.....................................

565. РЕЗУЛЬТАТЫ ПРИМЕНЕНИЯ СТРОМАЛЬНО-ВАСКУЛЯРНОЙ ФРАКЦИИ ............ 625.1. КЛИНИЧЕСКАЯ КАРТИНА ................................................................................ 625.2. РЕЗУЛЬТАТЫ МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ .................................. 65КЛИНИЧЕСКАЯ АПРОБАЦИЯ ................................................................................... 72ЗАКЛЮЧЕНИЕ .....................................................................................................

77РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ... 79СВЕДЕНИЯ О ПРАКТИЧЕСКОМ ИСПОЛЬЗОВАНИИ РЕЗУЛЬТАТОВ..... СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ................................................................................................................................... 81СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ: ....................................... 82ВЕДЕНИЕАктуальность проблемыВпоследниедесятилетиянеуклоннорастетчисложивотных,страдающих офтальмопатиями различного генеза [42]. Среди них особоеместо занимают длительно незаживающие и рецидивирующие язвыроговицы [101].

Данная патология может иметь травматическую этиологию,а также может быть вызвана снижением трофики роговицы, анатомическимлагофтальмом, ожогами и многими другими факторами, приводящими кповреждению эпителия и более глубоких слоёв роговицы.Однимизнаправленийврегенеративноймедицинеявляетсяиспользование клеточных продуктов различного происхождения с цельюзамещения дефекта в поврежденном органе. В медицине человека притяжелыхповрежденияхроговицыклеточнаятерапияпоказываетобнадеживающие результаты, как в эксперименте, так и на практике, чтоотражено во многих современных источниках [5, 6, 9, 10, 12-14, 19, 20, 23,25].Вместе с тем, большинство подобных методов находится на стадиилабораторных и клинических испытаний, но некоторые из них уже завоевалисвое место в клинической практике.

Как известно, стволовые клеткиобладают способностью оптимизировать цитокиновый статус в клеточноммикроокружении после их локальной трансплантации в органы или ткани[12, 19].Лечение животных с заболеваниями и повреждениями роговицы глазапри выраженной несостоятельности процессов регенерации, приводящей висходе к значительному снижению остроты зрения и слепоте, остаетсяактуальной проблемой ветеринарной офтальмологии [24].В настоящее время, ведется поиск эффективных способов, которыепозволили бы успешно лечить пациентов с повреждениями роговицы иконъюнктивы, фиброзирующими кератоконъюнктивитами, незаживающимиязвами роговицы, тяжелыми формами синдрома сухого глаза.Для лечения животных с подобными состояниями используют, какизвестно,комплекснуютерапию,включающуювсебяприменениеантибиотиков, противовоспалительных, противовирусных лекарственныхсредств, а также препаратов, стимулирующих репаративные процессы вповреждённом эпителии роговицы.Методомэтиотропнойтерапииявляетсяиспользованиекератопротекторов – препаратов, стимулирующих регенеративные потенциироговицы.

Однако, при поражениях роговицы, затрагивающих болееглубокие слои стромы, эффективность кератопротекторов не всегда высока,ввиду их непосредственного контакта с дегенерировавшими тканямироговицы в зоне дефекта, что приводит, к последующему рецидивированиюпатологического процесса. Это влечет за собой ряд сложных хирургическихопераций, вплоть до пересадки роговицы, однако тактика её проведениятребует достаточно глубокого наркоза, который часто противопоказанживотнымгериатрическогопериодаонтогенеза,атакжеимеющимврождённые и приобретённые системные патологии [42].Однойизновейшихметодик,представляющихальтернативукератопротекторам, является использование клеточных технологий.

Вместе стем, многие сведения в данной области медицины являются фрагментарнымиипротиворечивыми.Следуетподчеркнуть,чтовветеринарнойофтальмологии клеточные технологии до настоящего времени используюттолько в клинических исследованиях, не имеющих экспериментальногообоснования,очемсвидетельствуетпроведенныйнамианализотечественной и зарубежной литературы [75, 76, 82, 84, 94, 98, 103, 104, 118,123, 124, 127].Исходя из вышеизложенного, нами на моделях травматическогоповреждения роговицы у кролика было предпринято исследование по оценке2возможностиприменениястромально-васкулярнойфракцииклеток,мезенхимных стволовых клеток жировой ткани и лимбальных стволовыхклеток в регенеративной медицине, путём введения их суспензированнойвзвеси субконъюнктивально.Цель настоящего экспериментального исследования - установитьзакономерности и особенности заживления моделированного поврежденияроговицы у кролика при использовании разных типов клеточных продуктов.Для достижения поставленной цели было необходимо решение рядаконкретных задач:1.

  В условиях моделированного повреждения роговицы у кроликавыявитьпролиферативныйпотенциалклеточныхпродуктовследующих типов: стромально-васкулярной фракции; аллогенныхстволовых клеток лимба; аллогенных стволовых клеток жировойткани.2.   Установитьсравнительныеморфологическиепоказателидинамики репаративной регенерации поврежденного эпителияроговицы при использовании клеточных продуктов указанныхтипов;3.   На основании клинико-морфологических данных, определить типклеточного продукта, оптимальный по регенераторным свойствам;4.

  Выявить источники репаративного морфогенеза роговицы вусловияхприменениеэкспериментальногостволовыхклетокповреждениякакиобосноватьиндуктораклеточногопролиферативного потенциала ткани роговицы при замещении еедефекта;35.   Провестиклиническуюапробациютерапевтическойэффективности стволовых клеток при лечении животных сповреждениями роговицы и установить целесообразность иэффективность применения их трансплантации при даннойпатологии.Научная новизнаОбоснованаиспользованияиэкспериментальноклеточныхпродуктовподтвержденаразныхтиповвозможностьвветеринарнойофтальмологии для восстановления анатомической целостности роговицы,чтоподтверждаетсяустановленнымиуподопытныхживотныхеефракциинаморфологическими характеристиками.Впервыерегенерациюоцененороговицывлияниеприеестромально-васкулярнойповрежденияхуэкспериментальныхживотных.Результаты гистологического исследования позволяют заключить, чтоскорость и качество заживления дефекта роговицы глаза у животных послеприменения клеточных продуктов превосходят таковые у животных приспонтанном заживлении, что может свидетельствовать о пролиферативныхпотенциях стволовых клеток.Теоретическая и практическая значимость исследованияУстановлено, что изучаемые типы клеточных продуктов после ихтрансплантацииэкспериментальнымживотнымвосстанавливаютанатомическую целостность и функциональную состоятельность тканейроговицы в области повреждения.

Оценено влияние клеточных продуктов иразработаны критерии оценки течения репаративного процесса.4На основании данных микроморфометрии выявлены морфологическиепоказатели, подтверждающие, что клеточные продукты могут выступать вкачестве индуктора репаративной регенерации повреждённых тканей глаза.Установленызакономерностииособенностирегенераторногопотенциала тканей роговицы в условиях моделированного повреждения споследующей трансплантацией клеточных продуктов.Сравнительный анализ регенераторного влияния изученных намиразных типов стволовых клеток показал, что эпителизация зоны дефектароговицы у животных после введения лимбальных стволовых клетокпроисходила активнее в сравнении с животными, которым вводили другиеклеточные продукты.Представлено научное обоснование терапевтической эффективностиклеточных продуктов различных типов при повреждениях роговицыразличной этиологии.Методология и методы исследованияИспользовали современный методологический подход, направленный наустановление закономерностей репаративной регенерации поврежденныхтканей в области индуцированной травмы.Полученные результаты эксперимента по применению стволовых клетокв ветеринарной офтальмологии являются базовыми для использования впрактическойветеринарноймедицинеприрегенеративнойтерапииповреждений роговицы глаза и могут быть использованы в клиническойрегенеративной медицине при восстановлении анатомической целостностироговицы в условиях ее повреждений.5Положения, выносимые на защиту:1.