Диссертация (Изменения цитоархитектоники, метаболической активности нейронов и экспрессии эстрогеновых рецепторов в ядрах гипоталамуса и передне-базального комплекса мозга человека при старении, болезни Альцгеймера и сосудистом слабоумии), страница 7

В то же время другие авторыпришли к выводу об улучшении познавательных функций у женщин с БоАл нафоне приёма эстрогенов (Asthana et al., 1999) и подтвердили, что снижение36содержания эстрогенов после менопаузы может служить важным пусковымфактором в патогенезе БоАл, так как женщины с высокой концентрациейбиологически доступного эстрадиола в меньшей степени подверженынарушениям познания, чем женщины с его низкой концентрацией (Inestrosa etal., 1998; Manly et al., 2000; Yaffe et al., 2000b).Учитывая вышесказанное и принимая во внимание аддитивный эффектэстрогенов при приёме такрина (Schneider et al., 1996), одной из задачпоследующихсобственныхисследованийсталоизучениеэкспрессииэстрогеновых рецепторов, опосредующих эффекты эстрогенов, в ядрахпередне-базального мозга и гипоталамуса при БоАл.Эстрогеновые рецепторы  и ЭР человека принадлежит к семейству ядерных рецепторов гормонов ифункционирует в качестве транскрипционного фактора, зависящего отсвязывания с лигандом (Hirata et al., 2003).

Транслируемая последовательностьЭР представлена восемью экзонами (Greene et al., 1986; Ponglikitmongkol et al.,1988).Первыйэкзоничастьвторогоэкзонакодируютфункциютранскрипционной активизации (AF1), локализованную на N- конце рецептора(Garcia-Pedrero et al., 2003). Второй и третий экзоны кодируют домен длясвязывания с ДНК, необходимый для специфичного связывания с ДНК итранскрипционной активизации через эстроген-чувствительные элементы.Экзоны 4-8 кодируют домен белка ЭР для связывания с лигандами, включаядетерминанты для ассоциации с белками теплового шока в цитоплазме, лигандзависимой димеризации рецептора и функцию активизации AF2 дляобеспечения транскрипции генов посредством ко-активаторов (Garcia-Pedrero etal., 2003).

Помимо классической мРНК ЭР, эти экзоны образуют целый рядизоформ/сплайсинговых вариантов, которые были классифицированы на семьтипов (Hirata et al., 2003). Наиболее часто встречаются сплайсинговыепродукты, у которых при обработке первичного транскрипта выпадают одинили более экзонов (Ferro et al., 2003). Более того, в нормальных (здоровых)37тканях чаще наблюдаются варианты с выпадением одного экзона, тогда какполовина вариантов в тканях, поражённых злокачественными процессами,лишается более одного экзона (Ferro et al., 2003; Poola and Speirs, 2001). Почтивсе описанные варианты экспрессируются как в здоровых, так и внеопластических тканях в дополнение к классическому транскрипту полнойдлины (Ferro et al., 2003). Основное внимание в литературе уделялосьсплайсинговому процессу ЭР в опухолях и клеточных линиях, тогда какданных о сплайсинговых вариантах в мозге человека и при БоАл до настоящегоисследования опубликовано не было.Поэтому на следующем этапе работы изучались сплайсинговые вариантыЭР в гипоталамусе случаев с БоАл и пожилых контрольных случаев,используя цепную реакцию полимеразы (ЦПР).

Это исследование проведено вММЯ, которое может быть легко изолировано из замороженной ткани мозга,требуемой для применения названной методики.Эстрогеновый рецептор  (ЭР) имеет сходное с ЭР строение. Егодомен для связи с ДНК идентичен таковому у ЭР на 96%, а домен для связи слигандами – на 53%. Отличаются эстрогеновые рецепторы  и  в основномструктурой N конца рецептора с трансактивационой функцией AF1 и строениемдомена D с сигналом ядерной локализации и частью лиганд-зависимойтрансактивационной функцией AF-2a (Ogawa et al., 1998). Исследования in vitroпродемонстрировали противоположные эффекты ЭР  и  на эстрогениндуцированную транскрипцию. ЭР опосредует её активизацию, а ЭР подавление (Paech et al., 1997).Литературные сведения об изменении концентрации циркулирующих вкрови эстрогенов при БоАл крайне противоречивы.

По данным Manly et al.(2000) уровень эстрогенов при БоАл снижается. Однако, есть сведения как оповышении уровня эстрогенов при этом заболевании (Hogervorst et al., 2002),так и об отсутствии значимых различий (Cunningham et al., 2001). По данныммногочисленных исследований эстрогены могут синтезироваться в нервной38ткани de novo, поэтому локальный уровень эстрогенов, определяемый вструктурах мозга, складывается из концентрации циркулирующих и локальнообразующихся эстрогенов. В связи с этим одной из задач настоящей работыстало исследование содержания в указанных ядрах передне-базального мозга игипоталамуса маркера локального биосинтеза эстрогенов в мозге,- ароматазы.АроматазаЦитохром Р-450 ароматаза человека (P450аром) - ключевой ферментбиосинтеза эстрогенов, который кодируется геном CYP19, находящимся на15q21.2 (Ларионов и соавт., 1998, 2000; Harada, 1988; Means et al., 1989).Несмотря на наличие нескольких альтернативных первых экзонов и 9различных начальных транскрипционных участков с индивидуальнымипромотерами, характеризующимися тканевой специфичностью, образующийсяв различных тканях белок одинаков независимо от используемого промотера(Meinhardt and Mullis, 2002).

Экспрессия ароматазы в мозге человека совсемнеобязательно находится под контролем специфичного для мозга первогоэкзона, описанного Honda и соавт. (1994). Напротив, в гипоталамусе человека илимбическихструктурахдовольночастоотмечаетсяутилизациямножественных разновидностей первого экзона (специфичного для мозга,гонад, фибробластов) с высокой вариабельностью в различных областях мозгаи у различных субъектов (Sasano et al., 1998).

Эти данные делают выбориммуноцитохимическогоисследованияпредпочтительнымдляизученияароматазы. P-450аром катализирует превращение тестостерона в эстрадиол,андростендиона в эстрон и 16 -гидроксилированного дегидроэпиандростеронав эстриол (Meinhardt and Mullis, 2002; Stoffel-Wagner, 2001). Ароматизацияможет быть важной детерминантой локальной концентрации эстрогенов вконкретной популяции клеток-мишеней (Weisz, 1982).

Многочисленныеисследованияуказываютнанейропротективнуюрольароматазыприповреждениях мозга и других патологических состояниях, включая болезньАльцгеймера (БоАл) (Azcoitia et al., 2001; Garcia-Segura et al., 1999; Wozniak et39al.,Нейропротекция1998).посредствомароматазыобъясняетсянейротрофическими эффектами эстрадиола (Wise et al., 2001), который спомощью P-450аром образуетсяиз своего предшественника тестостерона(Azcoitia et al., 2001; Wozniak et al., 1998).На основании выше изложенных литературных сведений был сделанвывод о необходимости изучения изменений метаболической активностинейронов ядер гипоталамуса и передне-базального мозга при наиболее частыхформах слабоумия, а также рассмотрения этих структур в качестве мишенейдля заместительной терапии эстрогенами.

Учитывая важную роль половыхстероидов в регуляции функциональной активности нейронов, в настоящейработе изучались возрастные изменения цитоархитектонических показателей(аппарата Гольджи и перикариона нейронов), отражающих синтетическуюактивность нейронов, у мужчин и женщин. Уровень метаболическойактивности нейронов в этих группах затем сопоставлялся с уровнем экспрессииэстрогеновых рецепторов и ароматазы.Методы оценки метаболической активности нейроновСнижение уровня метаболизма нейронов, предшествующее нарушениюпознавательныхфункций,нейродегенеративныххарактернозаболеваний.Подляпроцессовданнымрядастаренияиисследователейстимуляция нейронов может предотвратить или задержать возрастнуюдегенерацию.

Эта теория известна, как «use it or lose it» («используй илипотеряешь») (Swaab, 1991). Предложены и методы лечения, направленные настимуляцию метаболической активности нейронов (Swaab et al., 2003).Например,внастоящеевремясуспехомиспользуетсяактивизациядегенерирующих нейронов супрахиазматического ядра при воздействии яркогосвета. У пациентов с болезнью Альцгеймера при этом уменьшаетсядепрессивнаясимптоматикаи(Riemersma-van der Leek et al., 2008).нормализуютсяциркадианныеритмы40Методыоценкиметаболическойактивности(МА)нейроноввцентральной нервной системе (ЦНС) можно разделить на 1) прижизненные,неинвазивные и 2) предназначенные для изучения на аутопсийном материале.Классификация может основываться и на дисциплинарной или техническойпринадлежности методик:I Радиологические:1.

функциональная магнитно-резонансная томография (фМРТ) (Божко иАхадов, 2006)2. позитрон эмиссионная томография (Herminghaus et al., 2003; McGeer etal., 1989)3. ядерно-магнитная резонансная спектроскопия (1Н-MRS) (Capizzano etal., 2000; Mader et al., 2008; Najm et al., 1998; Schuhmann et al., 2002)II Электрофизиологические1. неинвазивная электроэнцефалография2. регистрация электрической активности отдельных нейронов или ихгрупп (ядер) (Саркисян и соавт., 2007)III Авторадиографические1.

2-деоксиглюкозный метод (Konkle et al., 1999; Uribe-Querol et al., 2005)2. in situ гибридизация мРНК цитохромоксидазы (Gourfinkel-An et al.,2002; Simonian et al., 1995)3. in situ гибридизация мРНК c-fosIV Иммуноцитохимические (выявление с помощью антител белка:1. цитохромоксидазы2. c-fos (Bullitt, 1990; Dragunow and Faull, 1989)3. аппарата Гольджи (Dubelaar et al., 2006; Gonatas et al., 2006; Salehi etal., 1994; Salehi et al., 1995a; Salehi et al., 1995b)V Гистохимические (оценка активности ферментов:1.

цитохромоксидазы (Kish et al., 1992; Simonian et al., 1995; Wong-Riley,1989)412. сукцинатдегидрогеназы (Uribe-Querol et al., 2005)3. гликоген фосфорилазы (Konkle et al., 1999)4. креатин киназы (Maker et al., 1981)5. 3,4 – дигидроксифенолуксусной кислоты (Gillon et al., 1990)6. цитрат-синтетазы (Browneet al., 1997)7. других (аденилат киназа, гексокиназа и др.) (Maker et al., 1981)VI Морфологические (определение1. размеров перикарионов нейронов (Боголепова и соавт., 2007; Ishuninaet al., 2003; 2004)2. размеров ядер и ядрышек нейронов (Курская и соавт., 2007)3.

количества 1) свободных рибосом, 2) полисом и рибосом в полисомахи 3) рибосом в составе гранулярной эндоплазматической сети (Курскаяи соавт., 2007)4. количества митохондрий и целостность их крист (Курская и соавт.,2007)5. интенсивностиокраскинейроновпоНисслю(гиперхромные,нормохромные, гипохромные) (Деревянко и соавт., 2007; Курская исоавт., 2007)площади среза, занимаемой кровеносными сосудами(Uribe-Querol et al., 2005).Различныеметодикиметаболическойподразумеваютактивностиопределениенейронов.разныхтиповРадиографические,авторадиографические, гистохимические и иммуноцитохимические оцениваютобщий уровень метаболизма, электрофизиологические – электрическуюактивность нейронов, морфологические – главным образом синтетическуюактивность. Понятно, что радиографические методики, и особенно фМРТ,востребованывосновномклиницистамидлядиагностическихиисследовательских целей.