part3 (Е.Н. Шаповалова, А.В. Пирогов - Хроматографические методы анализа)

5. Капиллярный электрофорезМетод капиллярного электрофореза (КЭ) основан на разделениикомпонентов сложной смеси в кварцевом капилляре под действиемприложенногоэлектрическогополя.Микрообъеманализируемогораствора вводят в капилляр, предварительно заполненный подходящимбуфером – электролитом. После подачи к концам капилляра высокогонапряжения (до 30 кВ), компоненты смеси начинают двигаться покапилляру с разной скоростью, зависящей в первую очередь от заряда имассы (точнее – величины ионного радиуса) и, соответственно, в разноевремя достигают зоны детектирования. Полученная последовательностьпиковназываетсяэлектрофореграммой,приэтомкачественнойхарактеристикой вещества является параметр удерживаниямиграции),аколичественной–высотаилиплощадь(времяпика,пропорциональная концентрации вещества.

На рис. 37 показана схемаустановки для капиллярного электрофореза.Рис. 37. Схема установки для капиллярного электрофореза130На заряженную частицу в простейшем случае действуют двепротивоположно направленные силы – электростатического притяжения исопротивления движению частицы.

В равновесных условиях действие этихсилуравновешиваетдругдруга,искоростьмиграциичастицыопределяется выражением:µ = q .E/6πηr.(16)где q – заряд иона, а E – напряженность электрического поля. η- вязкостьсреды, r – радиус частицыЭлектрофоретическаяподвижностьµэфопределяетсякакскоростьдвижения частицы, деленная на напряженность электрического поля:µэф = vэф/Е.(17)где, vэф – скорость идеализированной сферической частицы.

ВПри проведении разделения в капиллярах особенно важное значениеприобретает электроосмотический поток (ЭОП), связанный с движениемдиффузной части двойного слоя, образующегося относительно заряженнойповерхности внутренней стенки капилляра (рис. 38).Рис. 38. Схема возникновения электроосмотического потокаКакправило,отрицательнозарядзаряженныхповерхностисиланольных131определяетсягруппнаналичиемповерхностинемодифицированных кварцевых капилляров или создается за счетдополнительной модификации поверхности.Результирующая подвижность частиц µ определяется суммойэлектрофоретической и электроосмотической подвижностей:µ = µ эф + µ эо.Этодаетопределенные(18)преимуществаприанализесмесейпротивоположено заряженных ионов, поскольку все определяемыекомпоненты будут двигаться в направлении детектора вследствие ЭОП.Однако скорость передвижения ионов с одинаковым направлениемэлектрофоретическойиувеличиваться,противоположеннымаэлектроосмотической–подвижностейбудетуменьшаться.Длянемодифицированного кварцевого капилляра в диффузной части двойногоэлектирического слоя присутствует некоторая избыточная концентрациякатионов, в результате движения которых возникает ЭОП, направленный ккатоду.Врезультатекатионыбудутперемещатьсябыстрееидетектироваться до ЭОП, а анионы медленнее и детектироваться послеЭОП, нейтральные молекулы движутся с ЭОП, как это показано на рис.

39.абРис. 39. Движение заряженных частиц в немодифицированном кварцевомкапилляре (а) и общий вид электофореграммы смеси частиц с различнымизарядами (б)132Для повышения воспроизводимости КЭ в присутствии ЭОП,электроосмотический поток должен быть постоянным в течение всехпроводимых определений, а сохранение постоянства ЭОП часто требуетзначительных усилий по подготовке до и после работы. В кварцевыхкапиллярах ЭОП уменьшается при увеличении концентрации электролитаи добавлении органических растворителей и возрастает с увеличением рН,а также зависит от вязкости раствора в капилляре и температуры. Если жепри добавлении катионных поверхностно-активных веществ (ПАВ) кразделительному буферу на поверхности капилляра адсорбируетсяположительный заряд (рис. 40), то ЭОП меняет направление и переноситразделительный буфер в направлении анода.Рис. 40.

Изменение направления электроосмотического потока примодификации кварцевого капилляра катионными поверхностно-активнымивеществамиУникальной особенностью ЭОП является плоский профиль потока вкапилляре. Такой профиль выгоден, поскольку уменьшается размываниезонразделяемыхвеществ.Следуетотметить,чтоэффективностьразделения в капиллярном электрофорезе прямо пропорциональна, а время133анализа – обратно пропорционально напряжению, приложенному кэлектродам.Разделение в КЭ может быть выполнено как с положительной, так иотрицательнойполярностьюэлектродов.ЗнаязначениярКадлякомпонентов пробы, можно выбрать буфер с подходящим значением рН иполярность электродов, чтобы образец двигался в сторону детектора.Скорость миграции зависит от напряженности электрического поля,которая обычно составляет 200-400 В/см.Варианты капиллярного электрофорезаСуществуетрядвариантовкапиллярногоэлектрофореза,отличающихся по принципам и механизму разделения.Капиллярныйзонныйэлектрофорез(КЗЭ)являетсянаиболеераспространенным вариантом КЭ и предполагает использование одногобуфера в качестве разделяющей среды.

Разделение компонентов пробыосновано на различиях в подвижности заряженных молекул или ионов.Метод находит широкое применение при определении пептидов, белков,аминокислот, лекарственных препаратов, неорганических ионов и многихдругих объектов.Капиллярный ионный анализ – это разновидность КЗЭ в которой дляопределения неорганических ионов, не поглощающих свет в УФ-областиспектра,используетсякосвенноефотометрическоедетектирование,достигаемое за счет введения в буфер для электрофореза коионов,поглощающих свет в УФ-области спектра. Вытеснение коионов в зонеопределяемого иона уменьшает фоновое поглощение буфера, чтовыражается в появлении отрицательного пика на электрофореграмме.

Так,при разделении катионов используют различные органические основания,например, бензиламин. При определении неорганических анионов в буферобычно добавляют катионное поверхностно-активное вещество, которое134модифицирует поверхность капилляра и изменяет направление ЭОП.Посколькунаправлениеэлектрофоретическогопотокаиэндоосмотического потока совпадают, то в этом случае возможныэкспрессные и высокоэффективные разделения.Капиллярная электрокинетическая хроматография основана наразделениинейтральныхчастицприихраспределениимеждудвижущимися в электрическом поле частицами и заполняющим капиллярэлектролитом.

Такое распределение может быть обусловлено действиеммолекулярныхсил,комплексообразованиемион-парными(лигандныйвзаимодействиямиобмен),биоспецифическимивзаимодействиями. Имеются следующие разновидности капиллярнойэлектрокинетическойхроматографии:мицеллярная,ионообменная,лигандообменная и др.В мицеллярной капиллярной электрокинетической хроматографии(МКЭКХ) в буферный раствор вводят ПАВ, например, додецилсульфатнатрия, что приводит к образованию мицелл, которые будут двигаться каноду, ЭОП – по направлению к катоду. Разделение основано на различнойстепени связывания компонентов смеси с мицеллами.

Этот метод широкоиспользуется для различных классов как нейтральных, так и заряженныхсоединений, например, фенолов, ароматических аминов и др.Капилляры для разделенияПодавляющеебольшинстворазделенийвКЭпроводятсиспользованием кварцевых капилляров имеющих внешнее полимерноепокрытие, обычно - полиимидное, улучшающее их механическуюпрочность, и значительно реже полимерные капилляры, например изтефлона. Внутренний диаметр капилляров колеблется в пределах от 25 до200 микрон, а длина капилляра в зависимости от поставленной задачи - отнескольких сантиметров до 1 метра. Поскольку внешнее полиимидное135покрытие непрозрачно в УФ-области, то участок покрытия удаляют исоздаютокноспециальнойдляУФ-детектирования.пластиковойкассете.КапиллярНадежноезакрепляетсявтермостатированиекапилляра является основным условием получения воспроизводимыхвремен миграции определяемого соединения и площади результирующегопика, что важно для количественного анализа.Выбор оптимальных размеров капилляра представляет собойкомпромиссноерешениемеждутребуемойчувствительностьюопределения и разрешающей способностью.

Используют капилляры свнутренним диаметром 25-50 мкм, что является компромиссным решениеммеждудостаточновысокойчувствительностьюиэффективностьюразделения.Модифицированныекапилляры.Первоначальнобольшинстворазделений в капиллярном электрофорезе проводили с использованиемнемодифицированных кварцевых капилляров. Однако, необратимостьадсорбции белков, пептидов, фрагментов ДНК, а также электростатическиевзаимодействия разделяемых соединений с внутренней поверхностьюкапилляров приводят к значительному снижению эффективности иразрешающей способности, невоспроизводимости разделений. Это требуетдополнительных усилий по регенерации капилляров или даже их замене.Главная цель модифицирования внутренней поверхности кварцевогокапилляра состоит в изменении величины и направления ЭОП дляулучшения эффективности разделения, а также снижения адсорбции.