part2 (Е.Н. Шаповалова, А.В. Пирогов - Хроматографические методы анализа)

4. Планарная (тонкослойная) хроматографияТонкослойная (планарная) хроматография занимает одно из ведущихмест в качественном и полуколичественном анализе сложных природных,фармацевтических, медикобиологических и химических объектов. Средидругих хроматографических методов планарную хроматографию отличаютследующие достоинства и особенности:– это единственный хроматографический метод, позволяющийпроводить полный анализ неизвестной смеси, поскольку исследовательимеет возможность проверить, не остались ли на старте неэлюированныекомпоненты;–попроизводительностипревосходитгазовуюивысокоэффективную жидкостную хроматографию, по крайней мере, напорядок; использует более простое и дешевое оборудование;– обладает высокой селективностью, которую легко варьировать,подбирая состав подвижной фазы; в отличие от ВЭЖХ нет ограничений ввыборе растворителей;–даетвозможностьодновременногоразделениянесколькихобразцов; использования однократного или многократного элюирования(приразличныхусловиях),атакжеодновременногоразделениякомпонентов одного и того же образца с помощью различных элюентов;–возможнаоптимизацияразрешающейспособностихроматографической системы при разделении сложной смеси только дляинтересующих компонентов, что позволяет экономить время;–возможночувствительностьюдетектированиеиселективностью,соединенийкоторыелегкосвысокойварьироватьподбором проявляющего реагента; полученные результаты разделениялегко оценить визуально;110–можнодетектированиясохранятьихроматограммыосуществлятьдляспектральнуюпоследующегоидентификациюхроматографических зон после разделения в любом диапазоне длин волн,включая ИК.У планарной хроматографии есть и некоторые недостатки:– ограниченная разделяющая способность из-за сравнительнонебольшой длины разделяющей зоны (3-10 см);– чувствительность ниже, чем в случае ВЭЖХ;–зависимостьрезультатованализаотокружающейсреды:относительной влажности, температуры, а также наличия загрязняющихвеществ в воздухе;–трудности в работе с образцами, имеющими высокуюлетучесть, а также с веществами, чувствительными к действию кислородавоздуха или света.Классическая, наиболее простая и широко используемая методикатонкослойной хроматографии включает проведение следующих основныхопераций:1) нанесение анализируемой пробы на слой сорбента;2) разделение компонентов пробы на отдельные зоны в потоке подвижнойфазы;3) обнаружение зон на слое сорбента (часто реагентом, образующим сразделенными веществами окрашенные соединения);4) количественная оценка полученного разделения, включая определениевеличины удерживания и определение содержания вещества в зонах нахроматограмме.Положение зоны вещества на хроматограмме характеризуетсявеличиной Rf, которая равна отношению расстояния от стартовой линии доцентра зоны вещества к расстоянию от стартовой линии до линии фронта.Значение Rf – величина постоянная для данного соединения в данной111системе и зависит от ряда условий: способа элюирования, качества иактивности сорбента, толщины слоя, качества растворителей, количествананесенноговещества,длиныпробегарастворителей,положениястартовой линии и почти не зависит от температуры.

По этой величинепроводят идентификацию компонентов в смеси.Накачестворазделениякомпонентовсмесивпланарнойхроматографии влияет большое число факторов: тип разделительнойкамеры; предварительное насыщение камеры и слоя сорбента парамиподвижной фазы; стартовый размер пятна; расстояние от старта донижнего края пластинки; относительная влажность воздуха лабораторногопомещения;среднийдиаметрчастициихформа;толщинаиравномерность нанесения слоя сорбента; наличие микроповреждений слоя;тип вещества, связывающего сорбент; скорость элюирования; объемрастворителя в камере; наличие примесей в элюенте; конвекция в газовойфазе внутри камеры.Для разделения смесей веществ в тонком слое сорбента применяютадсорбционную, распределительную и ионообменную хроматографию,отличающиеся,преждевсегохарактеромвзаимодействиймеждурастворенными веществами и твердой или жидкой фазами, с которыми онисоприкасаются.

На практике эти взаимодействия почти никогда непротекают изолированно, и разделение веществ обусловлено несколькимивзаимодействиями. При выборе подходящего варианта хроматографии впервую очередь следует обратить внимание на строение разделяемыхвеществ.Припомощиадсорбционнойираспределительнойхроматографии разделяются вещества, строение которых различаетсяприродой, числом и характером полярных и неполярных заместителей.При хроматографировании в тонком слое сорбента чаще всего применяютадсорбционную хроматографию, которая проще по выполнению, болееэффективна, а результаты анализа более воспроизводимы.112Сорбенты в тонкослойной хроматографииВ качестве сорбентов в ТСХ применяют материалы, которыеотвечают следующим требованиям: образуют химически и физическистабильные слои; не образуют ковалентных связей с разделяемымивеществами; не растворяются в подвижной фазе или перемещаются вместес ней по пластинке; не содержат компонентов, мешающих разделению илидетектированию; не имеют собственной окраски; не набухают и несжимаются под действием подвижной фазы.В качестве подложки для сорбента используется стекло, алюминеваяфольга, полимерные пленки (полиэтилентерефталат).

Для приданаиястабильности слоя сорбента на подложке используются различныесвязующие вещества: гипс (5-10%), силиказоль, силикаты щелочныхметаллов, полиакриламид, полиакриловый эфир, крахмал. К адсорбентучасто добавляют флуоресцентный индикатор для детектирования веществ,поглощающих в УФ-области спектра. С этой целью используют: смесьсиликатов цинка и магния; смесь сульфидов цинка и кадмия; вольфраматыщелочноземельных элементов.Большое значение, особенно для эффективности разделения, имеюттакиехарактеристикисорбентов,какдиаметрчастиц,среднеераспределение частиц по размерам и размер пор. В классическойтонкослойной хроматографии для производства пластинок используютсячастицы с размером 5 – 20 мкм.

Для высокоэффективной тонкослойнойхроматографии (ВЭТСХ) необходим сорбент, диаметр частиц которогосоставляет 5 – 7 мкм. Сравнение характеристик пластинок для ТСХ иВЭТСХ приведено в табл.22. Монолитные сорбенты представляют собойновое поколение стационарных фаз, которые могут быть использованы и впланарной хроматографии. Их получают прямой сополимеризацией113Таблица 22. Сравнение характеристик пластинок для классической (ТСХ)и высокоэффективной (ВЭТСХ) тонкослойной хроматографии.ХарактеристикиТСХВЭТСХСредний размер частиц, мкм5 – 205–7Толщина слоя, мкм250100, 200Количество проб1236 – 7230 – 50Длина пробега фронта растворителя, мм 100 – 150Время разделения, мин30 – 2003 – 20Количество растворителя, мл505 – 10поглощение100 – 100010 – 100флуоресценция1 – 1000,1 – 10Предел детектирования, нгметакриловых полимеров, например, сополимера глицинметакрилата иэтилендиметакрилата.

Монолитные стационарные фазы не содержатчастиц, а роль разделительного пространства выполняют поверхность иобъем проточных каналов (пор). Макропористая структура монолитныхсорбентов содержит как минимум два вида пор: макро- и мезопоры.Преимущества таких носителей заключаются в заметном повышениискорости и эффективности разделения, так как для них отсутствуютобычные диффузионные ограничения межфазного массообмена.Основные типы сорбентов, используемых в ТСХ, описаны ниже.Силикагельсиланольные–полярныйадсорбент,содержитактивныеи силоксановые группы, его применяют для разделениясоединений различной полярности.Оксидповерхностью,алюминиясодержит–полярныйактивные114адсорбентОН-группы,сгетерогеннойобладаетзаметновыраженными протоноакцепторными свойствами; его применяют дляразделенияароматическихуглеводородов,алкалоидов,хлоруглеводородов, стероидовФлоросил – основной силикат магния, занимает промежуточноеположение между оксидом алюминия и силикагелем; удобен дляразделения флаваноидов, стероидов и ацетилированных углеводородовПолиамидымеханизмом– группа полярных сорбентов со смешаннымразделения:карбоксамиднаягруппаответственназаадсорбционный механизм, метиленовые звенья – за распределительныймеханизм.

Эти сорбенты применяют для разделения пищевых красителей,флаваноидов, танинов, нитрофенолов, спиртов, кислот.Модифицированные силикагели с привитыми группами (амино,циано, диол-, С2-,С8-, С18-), отличными по полярности.Важной характеристикой сорбента является его активность, оназависит от содержания воды и понижается при увеличении содержанияводы в сорбенте.Для успешного разделения смесей веществ большое значение имеетвыбор сорбента. В первую очередь нужно исходить из свойствразделяемыхсоединений:гидрофобности),Насыщенныеихсодержанияуглеводородыирастворимостихарактераадсорбируются(гидрофильности,функциональныхслабоилигрупп.совсемнеадсорбируются на силикагелях и оксиде алюминия. Введение двойныхсвязей, особенно сопряженных, увеличивает адсорбционную способностьсоединений.Функциональные группы в еще большей степени усиливаютспособностьвеществфункциональныхкадсорбции.группвозрастаетАдсорбционнаявследующемCH=CH<OCH3<COOR<C=O<CHO<SH<NH2<OH<COOH.115способностьпорядке:Подвижные фазы в тонкослойной хроматографииРастворители,применяемыевтонкослойнойхроматографии,должны быть чистыми и осушенными.

Смеси веществ могут разделяться спомощью одного растворителя, однако обычно применяют системы,состоящие из двух, трех и даже четырех растворителей. Выборрастворителей определяется их элюирующей способностью, котораязависит от полярности растворителя, а также его протонодонорных ипротоноакцепторных свойств. Характеристика элюирующей способностинаиболее важных для ТСХ растворителей приведена в табл.23. и 24. Длякаждой новой пластинки систему растворителей следует готовить заново,так как в ней соотношение компонентов после хроматографированияизменяется.Таблица 23. Значения силы растворителя для неполярныхнеподвижных фазГруппа( поСнайдеру)IIРастворительSiВодаМетанол2-Пропанол02,63,9IIIТетрагидрофуран4,5IVАцетонитрил3,2Существеннуюрольприразделениивеществспомощьютонкослойной хроматографии играет количество наносимой смеси, оновлияет и на величину Rf и на разрешение пятен. Пробы испытуемыхвеществ массой от 0,1 до 50 мкг, наносят на пластинку в виде растворов вэфире, хлороформе или другом летучем растворителе.116Таблица 24.