Отзыв официального оппонента (Биосенсоры на основе дрожжевой культуры и ассоциаций микроорганизмов для определения биохимического потребления кислород)

Отзыв официального оппонентана диссертационную работу Юдиной Натальи Юрьевны «Биосенсоры на основедрожжевой культуры и ассоциаций микроорганизмов для определения биохимическогопотребления кислорода», представленную на соискание ученой степени кандидатабиологических наук по специальности 03.01.06 — биотехнология (в том числебионанотехнологии)Определение уровня органического загрязнения вод различных водоемов,техногенных растворов и выхода очистных сооружений является важной задачей,поскольку на основе этого анализа может приниматься решение о возможностяхиспользования этой воды. Для этого служат стандартные методы определенияпотребления кислорода биологическим (БПК) или химическим (ХПК) путем.

Основнымнедостатком определения ХПК, наряду с трудоемкостью измерения, является искажениерезультатов измерения наличием ряда соединений. Учет их влияния требуетдополнительных усилий и времени. Основным недостатком метода определения БПКявляется его длительность. И тот, и другой метод неприменим для оперативного анализасточных вод в случае залповых сбросов, поскольку их результаты появляются уже послетого, когда можно как-то остановить или уменьшить сам сброс. Таким образом,разработка экспресс методов анализа органических загрязнений природных итехногенных вод весьма актуальна. Именно этой проблеме посвящена диссертационнаяработа Натальи Юрьевны Юдиной.Целью диссертационной работы Натальи Юрьевны была разработкабиотехнологических основ создания биосенсора БПК на основе монокультур иассоциаций микроорганизмов. Для достижения поставленной цели диссертант поставил 6задач, в которые входило:- выбор штаммов микроорганизмов для использования в качестве элемента биосенсора;- разработка матрицы для иммобилизации микроорганизмов на поверхности кислородногодатчика, основой которой стал поливиниловый спирт, модифицированный Nвинилпирролидоном;- подбор искусственных ассоциаций микроорганизмов для их использования вбиосенсоре;- выявление поведения биосенсора при изменении рН, солености, температуры, а такженаличие тяжелых металлов;- разработка методики определения БПК с использованием биосенсорного анализатора;- разработка экспериментального образца анализатора и его апробация.Научная новизна.

Показано, что возможна иммобилизация микроорганизмоводновременно с формированием гидрогеля на основе поливинилового спирта с N1винилпирролидоном. Установлена структура поливинилового спирта при разныхсоотношениях поливинилового спирта, N-винилпирролидона и Ce4+.На основе сравнения основных характеристик биосенсоров с использованиеминдивидуальной культуры, искусственных и естественных ассоциаций микроорганизмовподобраны наиболее перспективные варианты.

Установлено, что дрожжи Debaryomyceshansenii ВКМ Y-2482 способны к окислению широкого спектра органических веществ,причем наличие засоленности и тяжелых металлов выше ПДК незначительно влияет наэтот процесс.Практическая значимость. Разработаны биосенсоры для определения БПК. Заоснову взяты одиночная культура D. hansenii и ассоциации микроорганизмов,характеризующиеся высокой чувствительностью.

Работа вносит практический вклад вразработку экспресс-методов анализа БПК и позволяет в будущем производитьэффективные анализаторы воды. Совместно с ООО «Эконикс-Эксперт» изготовленэкспериментальный образец биоанализатора. Разработана и аттестована в Гостандартеметодика определения БПК с использованием биосенсорного анализатора.Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов иметодов, результатов и обсуждения, выводов, списка опубликованных работ ицитируемой литературы.Обзор литературы содержит 4 раздела, в которых описаны стандартные методыопределения БПК, доступные в литературе методы определения БПК с использованиембиосенсоров, особенности биохимии дрожжевых клеток, а также методы иммобилизацииклеток, применяемые при разработке биосенсоров.

В целом литературный обзорохватывает необходимый и достаточный для понимания проблемы круг вопросов.Материалы и методы, обозначенные в диссертации как «Экспериментальнаячасть», включают использованные в работе методы, начиная от культивированиямикроорганизмов и приготовления геля и завершая описанием тонкостей по сборкекислородного датчика. С точки зрения оппонента все необходимые методы (заисключением ИК-спектроскопии) описаны, причем сделано это с достаточнойподробностью.Результаты и обсуждениеЭтот раздел (именуемый почему-то в диссертации «Обсуждение результатов»)последовательно описывает ход проводимых исследований, начиная с подбора штаммовдрожжей для иммобилизации. Выбор штаммов проведен на основе субстратнойспецифичности, стабильности во времени и ростовых характеристик микроорганизмов ивыглядит обоснованно.2В качестве полемики, а не замечания, хотел бы отметить, что очень часто приналичии в среде нескольких субстратов микроорганизмы не потребляют их одновременно,а начинают потреблять наиболее легко усваиваемый.

После исчерпания первогоначинается потребление второго и т.д. Поэтому выращивание или проведение анализа сотдельным субстратом не позволяет утверждать, что наличие двух компонентов в средеприведут к изменению сигнала по сравнению с одним. Другими словами, анализспецифичности хорошо бы в будущих исследованиях дополнить изучением откликамикроорганизмов в присутствии множественных субстратов.Разработана и охарактеризована матрица на основе гидрогеля поливиниловогоспирта с поперечными сшивками. На основе полученных результатов выявлена структураматрицы.

В данном разделе описаны эксперименты по иммобилизации дрожжей D.hansenii и ассоциаций из двух и трех штаммов. Определены чувствительность, рабочийдиапазон, операционная и долговременная стабильность биосенсоров на основеиммобилизованных микроорганизмов. Выявлена субстратная специфичность полученныхбиосенсоров. Изучено влияние рН, температуры, солености среды и наличия тяжелыхметаллов на активность дрожжей в окислении глюкозы и глутамина. Проведен тестовыйанализ различных образцов воды, показавший работоспособность разработанныхбиосенсоров. Описан экспериментальный биосенсорный анализатор БПК «Эксперт-009»,созданный с использованием полученных результатов.В целом результаты представлены понятно, с достаточной степенью подробности илогично направлены на достижение поставленной цели.

Полученные результаты являютсядостоверными. Обсуждение приведено одновременно с описанием результатов ивыглядит логично.Выводы вытекают из полученных результатов и являются обоснованными.Список цитированной литературы оформлен единообразно и аккуратно.Разумное использование обзоров в качестве цитируемой литературы позволило создатькомпактный список цитируемой литературы.Все результаты работы опубликованы и представлены на ряде конференций.Автореферат и публикации полностью отражают содержание диссертации.Диссертация хорошо проиллюстрирована, изложена четко и логично. Схемы,таблицы, рисунки занимают на ее страницах соответствующее место, согласующееся сизлагаемым текстом.Несмотря на хорошее впечатление о работе, имеются некоторые замечания.1. Литературный обзор содержит утверждения, которые не являются умозаключениемавтора, но и не относятся к общеизвестным фактам.

Такие утверждения следовало бы34.