Отзыв официального оппонента 2 (Биосенсоры на основе дрожжевой культуры и ассоциаций микроорганизмов для определения биохимического потребления кислород)

ОТЗЫВ ОФИЦИАЛЬНОГО ОППОНЕНТА на диссертацию Юдиной Натальи Юрьевны «Биосенсоры на основе дрожжевой культуры и ассоциаций микроорганизмов для определения биохимического потребления кислорода», представленную на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности 03.01.06- биотехнология (в том числе бионанотехнололгня) Актуальность темы исследования.

В биокаталитических сенсорах наиболее часто в качестве рецепторных элементов используются ферменты„которые требуется выделять и отделять нз биологических сред и организмов. Вместо ферментов в настоящее время широкое применение находят микроорганизмы, живые клетки или живые ткани, Использование микр< оганизмов способствует метаболизму большого разнообразия органических веществ, поэтому такой подход позволяет оценить загрязнение вод органическими соединениями и применяться для определения биологического потребления кислорода (БПК), например, с помощью электрохимических биосенсоров. Наибольшее распространение для определения БПК получили амперометрические биосенсоры, которые получают путем соединения амперометрического кислородного зонда (например, электрода Кларка) с пленкой микроорганизмов, способных метаболизировать органические соединения в воде с потреблением кислорода (респираторные сенсоры). При отсутствии органических соединений растворенный кислород диффундируется через слой микроорганизмов и частично поглощается дыханием микроорганизма.

Для эффективной работы БПК-сенсоров микроорганизм должен метаболизировать широкий спектр субстратов и поддерживать их метаболическую активность. Несмотря на достаточно активные исследования в области БПК-амперометрических биосенсоров до настоящего времени не до конца решены такие проблемы, как иммобилизация микроорганизмов и клеток, сохраняющая их жизнеспособность, чувствительностью. интерпретация сигнала сенсора, управление его микроорганизмов в сетчатую матрицу на основе поли винилового спирта, Вышеизложенное определяет актуальность темы диссертации Юдиной Н.Ю., посвященной изучению и созданию новых биосенсоров на основе дрожжевой культуры и ассоциации микроорганизмов для определения биохимического потребления кислорода.

Для достижения поставленной цели автором были поставлены и успешно решены задачи обоснования применения биологического материала для формирования биочувствительного элемента сенсоров, нового способа иммобилизации модифицированного Х-вин илии рролидоном, оценки выбора ассоциаций микроорганизмов для создания рецепторного слоя по сравнению с индивидуальными культурами или естественными ассоциациями 1активный ил), влияния рН, присутствия тяжелых металлов и электролитов на окислнтельную способность дрожжей, разработка методики оценки БПК с применением биосен сорного анализатора, разработка экспериментального образца сенсора и апробация его при анализе водных объектов.

Научная новизна диссертации обусловлена рядом позиций и сомнения не вызывает. Установлено, что при иммобилизации микроорганизмов в сетчатую структуру на основе поливи лилового спирта, модифицированного Х-ви нилл нрролндоном, позволяет сохранить жизнеспособность микроорганизмов и их катал итическую активность.

Структура матрицы подтверждена методом ЯМР-спектроскопии. Проведен сравнительный анализ характеристик амперометрических биосенсоров на основе индивидуальных микроорганизмов и ассоциаций микроорганизмов (естественных и искусственно составленных, с учетом субстратной специфичности). Впервые показано, что дрожжи способны окислять широкий круг органических соединений в присутствии высоких концентраций солей и ионов тяжелых металлов. О теоретической и практической значимости свидетельствуют разработанные автором новые способы иммобилизации целых клеток микроорганизмов в матрицу на основе поливинилового спирте, модифицированного Х-винилпирролидоном, обеспечивающие стабильность рецепторного слоя и пригодные для коммерческого использования. Биосенсоры кюветного типа для определения БПК, разработанные автором превосходят по чувствительности н экспрессности известные аналоги в РФ и за рубежом.

Результаты исследований позволили изготовить экспериментальный образец амперометрического биосенсора для определения БПК, разработана и атгестована в Госстандарте методика определения БПК с помощью биосенсорного анализатора. Диссертация Юдиной Н.Ю. изложена на 1б8 страницах текста, содержит бб рисунков и 24 таблицы. Она включает введение, 3 главы, выводы и список литературы, включающий 112 ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов. Во Введении приведено обоснование актуальности темы исследования, основных положений, составляющих научную новизну, практическую значимость и положений, выносимых на защиту.

Приведена характеристика методологии проведенного исследования, структура диссертация, апробации полученных результатов и публикаций по тематике диссертация. В Главе 1 дана общая характеристика методов определения БПК, в том числе с применением биосенсоров. Описаны применяющиеся в настоящее время биосенсоры с учетом природы физического преобразователя и биологического материала, в том числе индивидуальных культур и ассоциаций микроорганизмов.

Значительное внимание уделено биохимии дрожжевых клеток. В обзоре обстоятельно охарактеризованы способы иммобилизации, в том числе с использованием гидрогелей. Следует отметить умение диссертанта выполнять критический анализ большого числа литературных источников- обзор характеризуется глубиной и высокой степенью обобщения. Проведенный анализ позволил Юдиной Н.Ю.

обосновать актуальность темы исследования и выделить новизну получаемых результатов в разрабатываемом направлении. Глава 2 «Экспериментальная часть» содержит информацию о применяемых при проведении исследования штаммов дрожжей, описаны методики синтеза сетчатой полимерной матрицы на основе поливинилового спирта, модифицированного Х- виннлпирролидоном н установления ее структуры методом ЯМР-спектроскопии и топографии поверхности, содержащей и не содержащей клетки микроорганизмов с помощью сканирующего электронного микроскопа, Подробно описана методика иммобилизации дрожжей и процедура измерения отклика сенсора с применением многофункционального анализатора рН-метра-иономера-БПК-термооксиометра на основе кислородного электрода Кларка.

Здесь хотелось бы отметить широкий спектр применяемого современного оборудования, использование которого подтверждает достоверность результатов, приведенных в диссертации. Глава 3 «Результаты и обсуждение» включает 8 разделов. В части 3.1. описан процесс выбора биологического материала на основе индивидуальных культур микроорганизмов, способных окислять органические субстраты в природных и сточных водах. Оценена субстратная специфичность дрожжевых культур и отклики сенсоров, в которых они использовались в качестве чувствительных элементов. Охарактеризована устойчивость иммобилизованных микроорганизмов.

Особенно интересны исследования 1раздел 3.2,) по составлению искусственных ассоциаций микроорганизмов с целью расширения перечня окисляемых субстратов. Показано, что главным препятствием к практическому внедрению БПК-сенсоров на основе ассоциаций микроорганизмов является нестабильность их состава.

Для иммобилизации микроорганизмов предложена матрица на основе гидрогеля поли винилового спирта, модифицированного Х-винилпирролидоном (раздел 3.3.), обеспечивающую высокую емкость, хорошую диффузию субстратов и продуктов окисления, устойчивость в водных средах.

Сетчатая структура полимера и механизм протекания реакции подтверждены методом ЯМР и ИК-спектроскопии. Разработан способ иммобилизации дрожжей В.'латепй ВКМ У-2482 и ассоциации микроорганизмов в полимерную матрицу (разделы 3.4 и 3.5), Методом сканирующей электронной микроскопии изучена топография рецепторного слоя. Получены гиперболические зависимости отклика сенсора от БПК, которые были аппроксимированы с помощью уравнения Михаэлиса — Ментон.

Для снижения ошибок анализа предложено использовать линейный участок градунровочной кривой, ограниченный кажущейся константой Михаэлиса. Рассчитаны и сопоставлены характеристики БПК-сенсоров на основе ассоциаций микроорганизмов, активного ила с очистных сооружений и дрожжевой культуры 22Ьалзелй. И, наконец, в разделе 3.5 проанализировано влияние состава н характеристик исследуемых проб на окислительную способность дрожжей ОеЬагуотусез Ьапзепй ВКМ У-2482 и ассоциации микроорганизмов О. апуига, А.

ааелииюгапз, 22 Нагиеий (рН, температура, электролиты, ионы тяжелых металлов). Сенсоры апробированы при анализе реальных образцов природных, технологических н сточных вод (раздел 3.7). Использованию результатов исследования для создания экспериментального образца биосенсорного анализатора БПК «Эксперт — 009» посвящен раздел 3.8. Сформулированы основные результаты, использованные для создания высокоэффективного биокатализатора, описана конструкция прибора, включающего кислородный датчик. Разработан экспериментальный образец амперометрического биосенсорного анализатора для экспресс-определения БПК «Эксперт-009».

Характеризуя диссертацию в целом, можно сделать вывод о том, что Юдина Н.Ю. выполнила большое по объему и результативности исследование, относящееся к актуальной области биотехнологии. Диссертант владеет достаточным объемом научнотехнической информации, способен планировать и осуществлять экспериментальные исследования, правильно интерпретировать полученные результаты. Научные положения и заключения, сформулированные в диссертации, обоснованы и базируются на большом объеме экспериментальных исследований, выполненных на современном аналитическом оборудовании, поэтому сомнения не вызывают. Сделанные по диссертации выводы корректны и достаточно обоснованы.

Вместе с тем по работе имеется ряд вопросов„не влияющих на общую положительную оценку. 1. Замечания по оформлению диссертации и автореферата. Главу 1 правильнее было бы назвать «Обзор литературы», а не «Литературный обзор». Во введении было бы неплохо показать степень разработанности темы исследования, личный вклад автора, отразить методологию и методы исследования 2. Только из текста можно сделать вывод о принадлежности линейных зависимостей откликов сенсоров на основе различных биочувствительных элементов от БПКз, из рис.48 это непонятно.