Методы общей бактериологии (том 2) (Методы общей бактериологии в трех томах (ред. Герхардт))

МЕТОДЫ ОБЩЕЙ БАКТЕРИОЛОГИИ В ТРЕХ ТОМАХ Под редакцией Ф. ГЕРХАРДТА и др. Перевод е английского под редакцией чл.-корр. АН СССР Е. Н, КОНДРАТЬЕВОИ и проф, Л, В, КАЛАКУНКОГО МОСКВА «МИР» 1984 ББК гад М 89 УЙК 878.80.85 М 89 Методы общей бактериологии: Пер. с англ.!Под ред. Ф. Герхардта н др. — М.: Мнр, 1984. — 472 с., ил. Фундаментальное руководство. неписанное ученммн США и Ка. нады, па методам, широко исаальзуемым в современной бактериологии На русском акыне книга выходит в трех томах. Второй там посвящен генетическим методам и методам изучения обмена веществ бактерий Прелдавначева для специалистов, рзботазнщнх во всех областях мннробнологнн.

2008000000 — 208 М Свод. пд. подписных изданий 1988 ББК 87 А Редакция литература но биологии 1981 Атпег1сап Бос1е1у 1ог М1стоЫо1оду ф Перевод па русский язык «Мяр», 1984 Часть 111 ГЕНЕТИКА ВВЕДЕНИЕ И. Нестер Бактериальная генетика с момента ее зарождения в сороковых годах нашего века, когда Ледерберг и Татум впервые продемонстрировали генетическую рекомбинацию у кишечной палочки, развивается необыкновенно быстро. В настоящее время работающие в этой области исследователи пришли к детальному пониманию механизмов, посредством которых гены бактерий мутируют, переносятся и рекомбннируют. Не удивительно, что рождение и развитие молекулярной биологии имеет параллели с развитием бактериальной генетики; благодаря инструментам и методам, созданным специалистами в области бактериальной генетики, молекулярные биологи были обеспечены материалом для изучения.

Кишечная палочка не случайно представляет собой безусловно наиболее подробно изученный на молекулярном уровне организм: большинство исследований в области молекулярной биологии действительно зависит от тех генетических манипуляций, которые могут быть выполнены на этом микроорганизме. К инструментам исследований в бактериальной генетике относятся хорошо охарактеризованные мутанты, штаммы доноров и реципиентов, которые способны конъюгировать н рекомбиннровать, и геномы, которые можно выделять, а затем анализировать генетически и биохимически.

В данной части руководства описана техника работы с каждым из этих инструментов. В гл. 13 рассматриваются различные методы индукции, отбора и определения свойств мутантов для двух бактерий, чаще других используемых в генетическом анализе, — Езсйег!сй!а со!! и Васа!из зиб!!!сз. Эти же методы с некоторыми модификациями позволяют исследователям выделять мутанты большинства остальных бактерий. ЧАСТЬ ПЬ ГЕНЕТИКА Перенос генов был описан для относительно немногих бактерий; число их продолжает расти по мере того, как лучше изучаются условия, позволяющие продемонстрировать это явление в лаборатории.

В гл. 14 обсуждаются три известные системы переноса генов: трансформация, трансдукция и конъюгация. В некоторых случаях конкретные системы выбирались по той причине, что в них легко осуществим описываемый процесс (например, трансформация у Асте!обас1ег са1соасе11сиз), В других выбор определялся тем, что данная система изучается во многих лабораториях (например, трансдукция у Е. сой с помощью бактериофага Х). В гл. 15, посвященной плазмидам, описаны важнейшие методы выделения и характеристики молекул ДНК плазмид.

Эти методы постоянно улучшаются, а для некоторых систем они публикуются здесь впервые (например, выделение плазмидной ДНК с большой молекулярной массой). Авторы каждой из глав сами применяли большинство описываемых ими методов, поэтому они дают полезные рекомендации, а также обращают внимание на скрытые «подводные камни». В общем данная часть руководства должна оказаться полезной как тем, кто проводит эксперименты в области бактериальной генетики, так и тем, кто испвльзует бактерии в качестве инструмента в мвлекулярнобиолвгических опытах.

Для общей подготовки читателю предлагаются на выбор несколько книг по бактериальной генетике (1 — 51. Методы, связанные с использованием рекомбинантных молекул ДНК, дают бактериальной генетике новый мощный инструмент, значение которого трудно переоценить. Быстро меняющиеся методические подходы, их специальный характер и федеральные ограничения не позволяют включить эти методы в настоящее руководство.

Мы отсылаем читателя, интересующегося этими вопросами, к тому «Методов энзимологии», посвященному рекомбинантиой ДНК 161. ппидпнии ЛИТЕРАТУРА 1, Вгог!а Р. Р!аюп!6в. Ж. Н. Ргеегпап апй Со., $ап Ггапс!зсо, !979. 2, ра1йогв В. 1п1есбоиз гпи1!!р1е г!гид гез!в!айсе. Рюп 1!гойей, 1.опг!оп, 1975. 9. Л.вгв!л В. бепе ехргевв!оп, чо1.

1: Вас1ег!а1 йепопгез. Лойп чгг11еу апй Бонз, 1.опйоп, 1974. 4, 1.еэ!л В. Сене ехргевзюп, чо1. 3: Р1азпг!йз апг! рЬадев. Лойп %11еу апг! Бонз, 1опг!оп, 1977. 5. М!1!ег Л. Ехрег1птеп!в 1п гио!еси1аг йепеВсв. Сой Эрг!пд НагЬог 1.аЬога1огу, Со!д БрПпй НагЬог, Ы. г'., 1972. !Имеется перевод: Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике.

— Мс Мир, 1976.! 6. йги Я. (ег!.). КесопгЬ~пап1 014А. Ме!Ьог!з Епхупто1, 69, 1 — 555, 1979. Глава 13 МУТАЦИИ Б. Кэрлтон, Б. Браун Мутации, т. е. наследуемые изменения в генетическом материале, представляют собой важное биологическое явление. Будучи первоисточником всех биологических изменений, они наряду с механизмами переноса генов обусловливают генетическую изменчивость, поставляющую материал для эволюции. Мутации и индукции новых мутаций мутагенами представляют собой ценный инструмент в генетических и биохимических исследованиях.

Во-первых, изменения, которые вызывает мутация в определенном гене„позволяют не только идентифицировать этот ген, но н точно указать его место в хромосоме с помощью метода генетического картирования. Во-вторых, анализ мутантных штаммов, у которых нарушены различные этапы сложной цепи биохимических процессов, может вскрыть детали организации генетического и биохимического аппаратов. В-третьих, знание механизма действия различных мутагенов может помочь в установлении корреляций между мутагенным и канцерогенным действием множества факторов окружающей среды, таких, как химические агенты, радиоактивное излучение и другие физические факторы. Для того чтобы использовать мутагенез в генетических экспериментах с бактериями, необходимо согласованно провести ряд последовательных этапов работы, а именно: 1) определить, какой тип мутанта соответствует цели исследования; 2) выбрать наиболее подходящий мутаген для индукции желаемой мутации; 3) создать условия для выражения новой мутации; 4) произвести обогащение по желаемому мутанту для повышения вероятности его выделения; 5) обнаружить новый мутант соответствующими прямыми и непрямыми методами отбора; 6) изучить свойства мутанта и 7) картировать локус новой мутации, т.

е. определить ее расположение в бактериальном геноме. Методы, необходимые для осуществления первых шести этапов, описаны в равд. 13.1 — !3.7 этой главы; методы картирования рассматриваются в следующей главе. В данной главе описано также два специальных метода: один из них касается выделения штаммов, у которых мутации локализованы в определенном участке бактериального генома (равд. 13.8.1), другой служит для оценки мутагенности различных канцерогенов (равд.

13.8.2). Рецепты приготовления сред даны в равд. 13.9, список поставщиков бактериальных штаммов, специальных реактивов и оборудования приведен в равд. 13.10. Литературные источники обзорного типа по мутагенезу и выделению мутантов перечислены в равд. 13.11.1, а ниже приведена специальная литература по отдельным методикам (равд. 13.11.2). Подробные методики выделения мутантов определенного типа могут значительно различаться в зависимости от конкретных условий. Определенные штаммы, условия роста (среда, температура и т. д.) и концентрации мутагенов, оптимальные для одной бактерии, могут совершенно не годиться для другого вида и даже штамма того же вида. Поэтому методики, приведенные ниже, должны рассматриваться как отправная точка; при их налаживании в специальных целях или на других бактериях могут потребоваться значительные модификации.

13.1. ВЫБОР НУЖНОГО МУТАНТА Начиная поиски необходимого мутанта, прежде всего следует четко представлять, какой именно тип мутанта соответствует поставленной задаче. Например, если нужно получить мутант с устойчивым генетическим маркером, позволяющим идентифицировать мутантный штамм на всех этапах эксперимента, следует искать штамм с неревертирующей мутацией, захватывающей группу смежных генов, такой, как делеция.